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配制分离胶加入 立即注入玻璃板间隙并为浓缩胶留有足够的空间 注

归档日期:07-26       文本归类:加隙板      文章编辑:爱尚语录

  配制分离胶加入 立即注入玻璃板间隙并为浓缩胶留有足够的空间 注意梳齿长度约 。在胶顶层可加入几毫升灭菌双蒸水 聚合完成后 倒掉覆盖的液体 用灭菌双蒸水轻洗凝胶上部数次 尽可能吸干凝胶顶端残留的液体 确定所需浓缩胶的浓度和体积 配制浓缩胶 混匀后注入玻璃间隙 插入梳子 注意避免混入气泡 垂直放置于室温

  配制分离胶加入 立即注入玻璃板间隙并为浓缩胶留有足够的空间 注意梳齿长度约 。在胶顶层可加入几毫升灭菌双蒸水 聚合完成后 倒掉覆盖的液体 用灭菌双蒸水轻洗凝胶上部数次 尽可能吸干凝胶顶端残留的液体 确定所需浓缩胶的浓度和体积 配制浓缩胶 混匀后注入玻璃间隙 插入梳子 注意避免混入气泡 垂直放置于室温下约 在浓缩胶聚合的同时将样品与加样缓冲液混合 在浓缩胶聚合后去掉梳子 用灭菌双蒸水洗梳空数次 将凝胶放入电泳槽中 上下槽中均加入电泳缓冲液 按次序吸取上清加入到梳孔中 未使用的梳孔加入电泳缓冲液 电泳 开始时电压为 染料进入后分离胶后 增加到 染料到达底部时断电 终止电泳 取下凝胶 固定 染色 脱色。观察结果 见图 表达产物的分离和纯化诱导表达 分别取 表达阳性的菌液 加入到 剧烈振摇直到 离心收集菌体。 纯化样品的制备 加入 个体积的溶茵酶至菌体沉淀中 充分混匀 离心收集上清液 滤膜过滤即为待纯化样品。 使用 预装柱手工进行 融合蛋白的纯化 具体方法如下 扭转去除预装柱末端封口 用注射器中吸满 结合缓冲液缓慢推注通过预装柱 平衡柱子 用注射器将待纯化样品缓慢上样 保持流速在 重复上样 兰州人学硕 学位论文 的结合缓冲液洗涤柱子保持流速在 的洗脱缓冲液洗涤柱子保持流速在 重复沈脱 收集液体洗脱下来的 融合蛋白做 电泳 结果见图 的全菌体电泳重组表达质粒 转化阳性转化子在终浓度为 全菌体蛋白经电泳 考马斯亮蓝 染色可在约 处看到预期的融合蛋白条带。对照组空质粒 经相同条件诱导后表达的蛋白为 电泳图分析基因扩增片段为 分子量约 故表达融合蛋白分子量约为 。诱导表达后阳性条带位置与预期分子量位置相符 而未经 诱导的细菌总蛋白菌在此位置没有明显的蛋白条带出现。 兰州 人学硕 二学位论文 两种 融合蛋白分离纯化及 电泳 溶菌后的上清从图中可以看出两种 融合蛋白经沈脱缓冲液洗涤 附近出现单一条带纯化效果较好。兰州大学硕士学位论文讨论在抗生素耐药性 益严峻的情况下 抗菌肽由于其具有分子质量小、对热稳定和抗菌谱广 以及不同于抗生素的全新的抗菌机制 不易产生耐药性等特点 多年里抗菌肽的开发和应用已成为研究的热点 在动植物转基因工程及药物开发领域具有广阔的应用前景 有望成为抗生素的最佳替代品。然而大量的科研表明抗菌肽还存在很多亟待解决的问题 、抗菌肽的天然产量低 合成或从机体中提取步骤复杂、产率低、价格相当昂贵 利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。 、天然的抗菌肽抗菌活性与传统抗生素相比尚有不足 利用基因工程技术和蛋白质工程技术对天然的抗菌肽进行结构改造 提高抗菌活性发现高活性抗菌肽具有重要意义。如何提高抗菌肽分子的活性和最大程度降低其毒性成为其改造的目的。因此 设计并改造已存在的天然抗菌肽 获取具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用的新型抗菌肽已成为该领域研究的重要方向 人工设计并合成抗菌肽基因已经成为目前筛选新型抗菌肽的主要手段。杂合抗菌肽可集合不同抗菌肽的优点 使杂合分子具有比两个单独亲本更广的抗菌谱 更强的抗菌活性 同时降低某些亲本抗菌肽对真核细胞的毒性。杂合抗菌肽与其他抗菌肽相比 具有使用浓度低、为小分子肽类、低抗原性等特点 除抗菌能力外 它还具有杀伤有包膜的病毒、癌变细胞和低浓度促进伤口愈合等功能 使杂合肽可能成为一种有开发前景的新药。抗菌肽的结构功能研究以及杂合肽的分子设计 目前的主要设计策略为 改变抗菌肽两性分子的 螺旋的氨基酸组成 增强其螺旋度 将带电氨基酸引入抗菌肽片段以增加其带电荷数 寻找氨基酸数目最少的片段肽 以得到活性更高、抗菌谱更广的抗菌肽【鹪】。目前大部分集中于两亲 螺旋抗菌肽 原因在于 螺旋抗茵肽分布最广数量最多 并具有广谱抗性 、该类抗菌肽长度短 个残基 易于化学合成 、线性结构简单 易于通过圆二色谱分析和多维核磁共振进行结构测定。基于以上特点 两亲 螺旋抗菌肽已成为定量构效关系研究的首选对剩 】和杂合肽研究的主要对象。 兰州大学硕士学位论文天蚕素 一蛙皮素 杂合肽作为一种融合而成的抗菌肽片段 既保持了天蚕素 的广谱抗菌活性 而且获得一些蛙皮素的抗微生物活性 且没有溶血性 可望发展为一种新型的抗微生物药物。为了进一步研究 的结构与其抗微生物活性的关系 开拓其在抗微生物领域的应用前景 在本试验中我们利用生物数据库中的已知数据对 杂合肽蛋白质分子进行分析 运用基因工程技术从分子水平上研究其作用机理 再结合实验进行优化重组和定点突变 及其突变体在大肠杆菌中高效表达可以很大程度的提高生产效率 降低成本 促进无毒性抗微生物药物的发展 从而提高 杂合肽的临床应用水平 为以后的药用开发 规模化生产奠定基础。利用基因工程技术表达抗菌肽 提高外源基因表达水平一般有以下策略 工程化宿主菌 表达质粒的优化设计 大肠杆菌偏爱密码子的优化设计 提高目标基因 和目标基因产物的稳定性。我们在整个实验设计中贯穿了上述策略。现就实验中存在的一些问题和我们所持的观点加以讨论。一、 优化设计及克隆本实验中为使 在大肠杆菌中能更好地表达在获得目的 的方式上采取优化设计合成。根据 报道的 氨基酸序列 及依据 中的数据 针对大肠杆菌偏爱的密码子进行了优化 反推出优化后的 序列。同时根据克隆和基因表达的需要 在两端设计了与载体相对应的酶切位点 。两端采用的酶切位点不同这样可以保证在插入载体时是定向克隆 同时还可以降低载体的自连率。最终成功获得了长度为 的目的片段 并经查对与预先设计的序列完全一致。二、原核表达载体的选择和构建利用基因工程技术来表达重组蛋白可以利用真核表达系统和原核达系统两种方式。虽然真核表达系统可以实现有效的转录、表达 准确地完成糖基化 二硫键形成及翻译后的剪切等后期加工过程 较客观地表达天然蛋白质的结构和功能 维持全部活性 但真核表达系统表达水平一般都较低。因此本实验选用原核表达系统来表达 兰州大学硕士学位论文大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。大肠杆菌遗传图谱明确容易培养且费用低 对许多蛋白质有很强的耐受能力 能高水平地表达这些蛋白质。但是由于所要表达的蛋白质本身的一些特点和大肠杆菌系统自身的局限性 要根据许多因素来选择某种蛋白质的大肠杆菌系统 比如蛋白质的大小、蛋白质的需要量 表达蛋白是否需要保留活性 是否具有相应的后期纯化方法等等。就本实验而言 要获得重组 在原核表达系统的稳定表达我们需要解决的关键问题是克服肽抗生素对表达宿主菌的杀伤作用也就是工程菌表达“毒性”蛋白时的“自杀”问题。这是表达对宿主有害基因的关键问题。一般有两种措施可以解决这个问题。一种是融合表达法。在肽抗生素的 端连接一段适合在细菌中表达的蛋白质序列。宿主菌表达出这样的融合蛋白没有杀菌活性 就不会对宿主菌造成伤害。但是实践中加一段融合蛋白往往只能降低一部分杀菌活性 表达效果可能仍然不理想。另一种方法是采用诱导表达的载体系统。如果使用组成型表达载体 宿主菌生长初期即会有基因表达 有害产物比如抗菌肽会抑制细菌的生长繁殖或杀灭细菌 难以获得有效的表达。诱导表达的特点是 让宿主菌生长繁殖到相当高的密度后 才能进行诱导表达 这时产物对细菌会产生抑制 但仍可维持几小时的正常表达 表达量会大大提高。温度诱导型载体和 诱导型载体是两类常用的载体 诱导型载体的表达效果往往更为理想。本实验中采用 公司的 。该系统有三种载体 分别针对不同的密码子阅读框架。本实验选择了 保证插入的 的阅读框架一致。载体含有 启动子、 操纵基因、序列和 阻遏蛋白基因等。这类载体与其它表达载体的不同之处是 序列下游就是谷胱甘肽巯基转移酶 和目的基因的融合体。当宿主菌生长时 产生的阻遏蛋白与 操纵基因结合 阻碍了外源基因的转录和表达 此时宿主菌大量生长 当加入诱导物 阻遏蛋白不能与操纵基因结合‘则外源基因大量转录并高效表达。应用该载体系统进行 的融合表达具有如下的优点载体具有 强启动子 载体内含有 阻遏蛋白基因 可使目的基因与 融合蛋白一起在 诱导下高效表达 兰州火学硕士学位论文融合蛋白可保护目的蛋白在从细胞内分泌到细胞外时不被蛋白酶水解 表达的融合蛋白可用 亲合柱纯化 大大简化了纯化步骤 融合蛋白的存在可阻止 杀菌活性对宿主菌造成的损伤 影响表达效率 在制备抗体时 融合蛋白可作为半抗原辅助分子的目的蛋白产生抗体 融合部分有助于提高表达的目的蛋白的结构稳定性 这对于带有多个电荷的阳离子抗菌肽来说非常重要。三、 定点突变体外基因突变技术是研究基因功能和蛋白质性能改良的一种重要手段。随着分子克隆技术的发展 诞生了很多体外突变的方法【 。应用方法进行定点突变主要有以下几种 、大引物 、重组环形法。本实验中用的是反转 法。反转 进行基因突变可以直接对目的基因和载体一起扩增 免去先对目的基因突变后再将突变的目的基因亚克隆的过程 可将扩增产物直接转化到宿主细胞进行表达。其引物为一对背靠背的引物 其中一条含有突变的碱基 引物长度控制在 含量比例在 之间。 突变产物可以用 酶将末端填平。此方法突变基因的效率为 不足之处是必须与载体同时扩增目的基因 反应时间较长。实验中依据的结构特征及相关的文献报道对 密码子突变为 密码子 。在设计突变引物时 针对重组体 进行设计。实验中选用了 试剂盒 经测序结果表明达到了预期的突变结果。在进行突变的实验过程中我们发现了 的优点 以前的 突变技术中由于 过程中的错配率限制了这一技术的应用现在 使这一技术得到了最大程度的发挥。不仅具有超高的保真性 并且和 具有同样的扩增效率。与其他突变试剂盒相比本试剂盒的最大特点是操作方便、简单 只需一天时间便可完成整个操作 并且不受载体、宿主菌的限制。同时在使用突变引物进行 反应时 通过多次的 实验 我们发现虽然 技术是目前比较成熟的分子生物学技术 但是在 扩增较长目的基因时 也经兰州大学硕士学位论文常会出现非特异性的无目的条带 重现性不高的现象 很难通过一次 获得足够的目的基因。往往需要多次和不同条件的 才能够获得自己所需的目的条带。而且设计突变引物不能过长 突变碱基多设计在引物中间较为合理 否则会影响突变的特异性和高效性。四、融合蛋白的诱导表达合适的表达载体还需要选择合适的表达宿主菌。对于 公司推荐的最适表达宿主菌为大肠杆菌 因此我们将重组表达载体转化入大肠杆菌 诱导表达。利用 诱导目的蛋白的表达受到 浓度、温度、时间等多种因素的影响并难以从理论上预测。通过对表达条件的筛选和优化 我们确定了表达的最佳条件是 诱导表达小时。 的浓度对表达水平影响很大 是一个常规浓度 改变可以在 两个温度来比较结果显示 是外源蛋白的表达量最高。在确定最佳诱导表达时间时 我们设置了 小时不同的时间段。从 实验结果看小时以后表达的效果较好。五、表达蛋白的分离、纯化表达的融合蛋白首先要确定是以可溶的分泌形式或不溶的包涵体形式表达。由于包涵体不溶 细胞破碎后 很容易通过离心使包涵体与可溶性蛋白及膜蛋白区分开。破碎含有包涵体的细菌有超声处理、溶菌酶、反复冻融、弗氏压碎等方法 常用的是超声处理和溶菌酶法。本实验选用 公司的 亲和层析柱进行纯化。从 电泳结果可以看出诱导的融合蛋白是以包涵体形式存在的。沉淀的包涵体一般在强的离液剂 如尿素和盐酸胍 或变性剂如 等存在的条件下 或者在非生理 条件下都能溶解。变性蛋白溶解后几乎都没有活性 只有在体外折叠成天然或近似天然的构象后才能恢复活性。能否形成有活性的蛋白受很多因素的影响 包括疏水性氨基酸的大小、数目和分布 多肽中重复结构的数目 多肽的纯度、浓度及大小 溶液的 和离子强度 分子中二硫键的数目及折叠速率等。一般说来 蛋白质的复性效率在 左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度 变性剂的起始浓度和去除速度、温度、 兰州大学硕士学位论文 、氧化还原电势离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。在实验中 我们将包涵体蛋白经变性和复性处理变为溶解形式 通过 亲和层析柱进行洗脱 。获得了 电泳观察发现两种融合蛋白经洗脱缓冲液洗涤后 附近出现单一条带纯化效果较好。六、需要迸一步研究的问题 、由于时间原因 的分离、进一步的纯化和复性我们将在下一阶段的研究中进行。 、有研究报道 杂合肽 对细菌、病毒均有作用 有关其抗病毒活性的研究将在以后的实验中进行。 、结合计算机软件辅助设计对 进行其他基因改良 以寻求更为高效、高表达的抗菌肽基因。本实验通过化学合成方法获得了优化设计的 序列 构建了克隆重组体 和表达重组体 准确突变了 密码子构建了突变重组体 进行原核表达并分离纯化。两者的抗病毒活性研究将有待下一步的实验研究。 兰州大学硕士学位论文结论 本实验获得了适合大肠杆菌高效表达的优化的 序列 构建了克隆重组体 经过基因克隆、测序鉴定 与预先设计的序列完全一致。 本实验成功构建了融合表达体系 本实验用反转定点突变技术成功实现了对 密码子的突变成功构建了融合表达体系 诱导在大肠杆菌 中成功表达了 分析结果表明表达的融合蛋白的分子量约为 与预期的蛋白质分子量相吻合。 通过 亲和层析柱纯化获得了纯化的

  天蚕素A蛙皮素杂合肽及其突变体在大肠杆菌中的融合表达表达,肽的,及其,天蚕素A,表达及其,蛙皮素,杂合肽,突变体,天蚕素,天蚕素 A

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